În acest moment, am putea foarte ușor să ne întrebăm ce legătură are o sursă de alimentare cu PCR, dar în spatele scenei, industria surselor de alimentare și cele mai recente tehnologii de alimentare digitală au contribuit în mare măsură la eficientizarea și acuratețea procesului PCR. Înainte de a dezvălui cum, haideți să ne întoarcem în timp, la originea a tot ceea ce este.
Citind în interiorul dublului helix!
Cu toții am învățat la școală despre materialul ereditar uman cunoscut sub numele de acid dezoxiribonucleic, sau ADN, care poartă toate informațiile și instrucțiunile genetice necesare pentru ca organismele să se dezvolte, să crească, să supraviețuiască și să se reproducă. Descoperit inițial în 1866 de Gregor Mendel, cunoscut ca “părintele geneticii”, oamenii de știință au descoperit, mulți ani mai târziu, cum să descifreze codul secret al ADN-ului și cum ar putea fi folosit cel mai bine pentru binele umanității.
Figura 1: Structura dublului helix a ADN-ului. (© National Human Genome Research Institute)
Respectând numărul mare de oameni de știință care fac descoperiri, o piatră de temelie majoră a fost atinsă în 1953, când James Dewey Watson și Francis Harry Compton Crick au publicat despre structura dublului helix al ADN-ului care se răsucește pentru a forma structura tipică în formă de scară pe care am văzut-o cu toții în multe forme reprezentative (Figura 1). Munca lor a fost răsplătită în 1962 cu Premiul Nobel pentru Medicină, pe care l-au împărțit cu Maurice Hugh Frederick Wilkins, pentru descoperirile lor privind structura moleculară a acizilor nucleici și semnificația acesteia în transferul de informații în materia vie.
Compoziția ADN-ului este asemenea literelor individuale din alfabet. Atunci când sunt combinate unele cu altele într-o anumită ordine, ele se unesc pentru a forma cuvinte, propoziții și povești. Citirea cărții și înțelegerea conținutului acesteia au necesitat cercetări intense și abia în martie 2022 oamenii de știință au cartografiat în sfârșit primul genom uman complet, compus din peste 3 miliarde de perechi de baze. Este greu de vizualizat ceea ce reprezintă, dar tradus în ceva mai tangibil ar fi echivalentul unei cărți cu un milion de pagini – o mulțime de lecturi de citit la culcare.
Finalizarea genomului uman a fost posibilă datorită unui număr mare de inovații tehnologice, de exemplu, metoda de secvențiere a ADN-ului de la Oxford Nanopore, care poate secvenția până la 1 milion de litere de ADN deodată, dar cu unele greșeli și metoda de secvențiere a ADN-ului PacBio HiFi, care poate citi 20.000 de litere cu o precizie de 99,9%. Realizări mărețe, dar ambele nu ar fi fost posibile fără descoperirile unor mari inventatori.
Înțelegerea ADN-ului a însemnat atât un domeniu de cercetare foarte important, cât și un set de instrumente în curs de dezvoltare pentru decodare, acesta fiind visul oricărui biochimist și ar merita să îl menționăm pe Kary Banks Mullis, deoarece în 1983 a inventat testul PCR, care a contribuit la impulsionarea cercetării și a vitezei de înțelegere aprofundată a ADN-ului.
Mașina de copiat ADN s-a născut!
Dr. Kary Banks Mullis
Legendă urbană sau realitate? se spune că, în 1983, în timp ce conducea dinspre Bay Area spre cabana sa din Mendocino, precum un fulger de pe cerul Californiei, Dr. Kary Banks Mullis și-a imaginat o modalitate de a identifica cu precizie o anumită porțiune de ADN și de a sintetiza o cantitate enormă de copii. La acea vreme, Mullis lucra pentru compania Cetus și se concentra pe transformarea viziunii sale într-un proces.
După mai multe peripeții, în 1987, Mullis a trimis o lucrare la revista Nature: “Methods in Enzymology”, care a fost declanșatorul evoluției PCR. În 1993, a primit Premiul Nobel pentru chimie pentru invenția reacției în lanț a polimerazei (PCR). Procedeul, pe care Mullis l-a conceptualizat în 1983, este salutat ca fiind una dintre tehnicile științifice monumentale ale secolului al XX-lea.
Ce este PCR și cum funcționează?
Figura 2: Procesul și ciclurile PCR. (© National Human Genome Research Institute)
Reacția în lanț a polimerazei (abreviat PCR) este o tehnică de laborator care permite producerea rapidă (amplificarea) a milioane până la miliarde de copii ale unui anumit segment de ADN, pentru a putea fi apoi studiat mai în detaliu. PCR presupune utilizarea unor fragmente scurte de ADN sintetic, numite primeri, pentru a selecta un segment din genom, care urmează să fie amplificat și apoi realizarea mai multor cicluri de sinteză a ADN-ului pentru a amplifica acel segment (figura 2). Acest lucru se realizează prin utilizarea unui proces specific, care necesită ca probele să fie plasate în tuburi și expuse la o termociclare foarte precisă, iar aici are loc întâlnirea dintre sursa de alimentare și ADN!
Acest proces include mai multe etape, dar trei sunt cele mai critice (denaturare, recoacere, extensie) și se repetă de mai multe ori pentru a realiza copii ale segmentelor de ADN (figura 3). Fără a intra în prea multe detalii, prezentăm mai jos un rezumat al celor trei etape critice:
Figura 3: Ciclurile și duratele PCR. (© PRBX)
Prima etapă – Denaturarea
Preparatul conținut în tub se încălzește la cel puțin 94°C. Căldura rupe legăturile de hidrogen ale probei originale de ADN și separă ADN-ul în șiruri simple.
Etapa a doua – Recoacerea
Temperatura este coborâtă la aproximativ 5°C sub temperatura de topire a primerilor, între 50 și 60°C, permițând primerilor ADN și enzimei ADN-polimerază să se fixeze pe catenele individuale de ADN care au fost separate de căldură. În acest moment, nucleotidele (A, T, C, G) din soluția de amestec adăugată se vor împerechea cu catenele individuale (separate) de ADN care au rezultat în urma procesului de încălzire.
Etapa a treia – Extensia
Temperatura este apoi crescută până la 72°C pentru a începe procesul de extensie. Odată ce segmentele se unesc, ele formează un nou filament complementar de ADN. O nouă moleculă de ADN dublu catenar duplicat a fost formată din fiecare dintre șirurile simple ale moleculei originale de probă. Când secvența este finalizată, temperatura este din nou crescută pentru a începe un nou ciclu.
Etapele de la unu la trei se repetă de aproximativ 30 până la 40 de ori, repetând automat ciclurile de încălzire și răcire ale procesului, ceea ce are ca rezultat dublarea secvenței de ADN de fiecare dată când se efectuează ciclul de încălzire/răcire. La finalul procesului se obțin milioane de copii ale eșantionului original.
Pasul patru – Extensia finală și depozitarea
Este necesară o etapă finală de extensie pentru a permite sintetizarea corectă a tuturor produselor PCR, de obicei la 72°C timp de 10 minute. În final, temperatura trebuie redusă la 4°C pentru a stoca produsul PCR până la analiză.
În funcție de ținta finală, de timpul sau de nivelul de precizie necesar, sunt adesea utilizate variații ale acestui proces, de exemplu, PCR cantitativă în timp real (qPCR), PCR cu transcriere inversă (RT-PCR), PCR cantitativă cu transcriere inversă (RT-qPCR), PCR digitală (dPRC) și PCR digitală în picături (ddPCR), PCR Microfluid.
Surse de alimentare pentru o procedură PCR eficientă
Figura 4: Echipamente tipice de laborator pentru PCR. (© PRBX/ Natatravel/Shutterstock)
Există multe aplicații medicale care necesită control termic, de exemplu, incubatoare neonatale, încălzirea sângelui pentru hemoliză, camere de incubare de laborator și așa mai departe. Majoritatea acestor aplicații necesită o reglare termică precisă și majoritatea surselor de alimentare medicale cu control al tensiunii de ieșire sunt potrivite pentru astfel de aplicații. În cazul echipamentelor PCR (figura 4) și a specificității ciclurilor termice cu precizie ridicată și secvențe repetitive, acestea necesită o soluție de alimentare specifică și adesea adoptă o abordare modulară cu grupul de alimentare și control încorporat în bucla de control termic PCR.
După cum se arată în figura 3, ciclurile termice sunt destul de scurte, necesitând ca elementul de încălzire să își ajusteze temperatura între +95C ridicat, +50C scăzut, +72C platou și înapoi la +95C după patru minute. Acest ciclu se repetă de 30 până la 40 de ori, cu un nivel de precizie foarte ridicat. Există diferite metode de a genera și controla temperatura în termocicloare, dar multe dintre acestea utilizează elemente cu efect Peltier. Dacă principala aplicație a efectului Peltier este răcirea, efectul Peltier poate fi utilizat și pentru încălzire sau pentru controlul temperaturii. De asemenea, ar putea fi asociat cu un alt element de încălzire, folosind, apoi, un histerezis controlat, pentru a răci camera termică.
Figura 5: Sursă de alimentare convențională cu control și monitorizare digitală prin intrare digitală, de exemplu, PMBus. (© PRBX)
Producătorii de termocicloare PCR au dezvoltat algoritmi foarte complecși pentru a regla și controla nivelul de temperatură cu o precizie ridicată. Odată cu introducerea tehnologiei digitale de alimentare și control și a managementului energiei, a devenit mai ușor să se interfațeze CPU-ul termociclorului cu etapa de comutare și să se controleze tensiunea și curentul prin intermediul unei interfețe digitale, de exemplu, PMBus, pentru a alimenta elementele de încălzire/răcire (figura 5).
Figura 6: Sursă de alimentare controlată de un semnal PWM extern care face parte din bucla de control PCR. (© PRBX)
În unele cazuri, semnalul PWM este generat de controlerul termociclorului și injectat în etapa de comutare a sursei de alimentare pentru a controla strâns parametrii fără pași suplimentari (figura 6). Deoarece etajul de alimentare este puternic integrat în bucla de control termic, devine adesea o parte a acesteia, iar proiectanții de surse de alimentare trebuie să lucreze în strânsă colaborare cu programatorii pentru a oferi cel mai optimizat timp de răspuns la o cerere specifică, ceea ce este foarte interesant și, într-adevăr, destul de diferit de modurile mai convenționale de lucru în proiectarea soluțiilor de alimentare.
Figura 7: Sursă de alimentare POWERBOX pentru o aplicație cu termociclor. (© PRBX)
Concluzie
De la descoperirea făcută de Dr. Kary Banks Mullis în 1983 și până la aplicarea în masă pentru a detecta prezența virusului SARS-CoV-2 în miliarde de probe, tehnologia PCR a jucat un rol foarte important în cercetarea medicală și în sănătatea publică. Acesta a fost, de asemenea, un domeniu foarte interesant pentru inginerii specializați în electronica de putere, care au proiectat soluții de alimentare (figura 7) în strânsă colaborare cu industria medicală pentru a dezvolta soluții de alimentare foarte specifice, cu un nivel ridicat de programare și integrare a sistemului.
Cine a spus că industria surselor de alimentare este plictisitoare?
Referințe:
Powerbox (PRBX): https://www.prbx.com/
Dr. Kary Banks Mullis: https://www.karymullis.com/
The complete sequence of a human genome: https://www.science.org/doi/10.1126/science.abj6987
National Human Genome Research Institute: https://www.genome.gov/
Autor: Patrick Le Fèvre,
Director Marketing & Communication
Despre autor: Patrick Le Fèvre este un specialist în marketing și inginer cu experiență, cu o carieră de 40 de ani de succes în domeniul electronicii de putere. El a fost un inițiator în promovarea noilor tehnologii, precum ‘putere digitală’ și al inițiativelor tehnice de reducere a consumului de energie. Le Fèvre a scris și a prezentat numeroase cărți albe și articole la cele mai importante conferințe internaționale de electronică de putere din lume. Acestea au apărut în peste 450 de publicații în mass-media din întreaga lume. De asemenea, este implicat în mai multe forumuri de mediu, împărtășindu-și expertiza și cunoștințele despre energia curată.
Powerbox – A Cosel Group Company
https://www.prbx.com
